合成された 5 の in silico および in vivo 肝保護活性

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4681 (2023) この記事を引用

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本研究では、雄ラットのジエチルニトロソアミン (DEN) によって誘発される肝損傷に対する、チオヒダントイン グループの独特な誘導体である 5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン (5B2T) の肝保護効果を調査しました。 実験動物は、それぞれ 14 匹のラットからなる 3 つのグループに分けられました。 グループ I のラットは対照とみなされ、10% の Tween 80 のみを投与されました。グループ II のラットには 200 mg/kg DEN が腹腔内注射されました。 グループ III のラットには、単回用量の DEN 200 mg/kg を腹腔内注射し、3 週間と 6 週間の 2 つの期間、経口投与 (50 mg/kg、5B2T) を受けました。 実験の最後に、肝機能、炎症誘発性サイトカイン IL-6 および腫瘍壊死因子 α (TNF-α) レベルの分析のために血液が採取されました。 さらに、肝臓標本は組織病理学的検査および免疫組織化学のために使用されました。 ラットに 200 mg/kg DEN を単回腹腔内注射すると、DEN 群では TNF-α および IL-6 の上昇とともに、肝細胞損傷の指標である AST、ALT、および ALP の血清酵素レベルが有意に上昇しました。 治療グループにおける LFT と ELISA の両方の結果は、マーカーのレベルの改善と低下を示しました。 組織病理学的検査では、DEN グループでは線維症、壊死、炎症細胞の浸潤が認められ、治療グループでは強度が低かった。 免疫組織化学的染色の結果、DEN グループでは HSA 抗体と Ki-67 抗体の両方の強い陽性染色が示されましたが、治療グループでは強度がはるかに低かったです。 ドッキング研究の結果は、5B2T が TNF-α (PDB ID: 1TNF) およびヒト IL-6 (PDB ID: 1IL6) と結合部位エネルギー - 7.1 および - 6.1 (kcal/mol) で顕著な相互作用を有することを示しました。それぞれ。 AutoDock プログラムを使用したコンピューター化された分子ドッキングを通じて、薬物と受容体の正しい吸収と結合が評価されました。 現在の研究結果の結論は、実験ラットにおける DEN 誘発肝細胞損傷および癌に対する 5B2T の興味深い肝保護能力を反映しています。

肝臓がんは、世界中で最も一般的かつ重篤な悪性腫瘍の 1 つであり、急速に増殖し予後が不良です。 肝臓がんは、通常の肝臓損傷として始まり、線維症に発展し、その後肝硬変に進行し、重篤な癌腫に至る可能性があります1。 肝細胞癌 (HCC) は単に肝臓癌として知られ、罹患率と死亡率が高い致死性の癌です。 肝臓がんの診断が難しい理由の 1 つは、進行期に達するまでは無症状であることが挙げられます 2。 肝細胞がんは悪性新生物細胞で構成されており、大部分が肝細胞に似ており、分化によって変化します3。 肝臓は最大の内臓であり、血液循環からの内部および外部の生物学的老廃物および代謝老廃物（胆汁、尿素、脂質など）の除去など、多くの重要な活動の遂行を担っています。 。 さらに、免疫系の多くの機能において非常に重要な役割を果たしています4。 現在、肝細胞がんの発生率は、高率のウイルス感染（例、HBV、HCV、HDV）、アルコール依存症、肥満により、先進国と発展途上国の両方で増加しています5。

ニトロソアミンは、人間と動物の両方に対して非常に強力で毒性があり、発がん性があると考えられている有毒化合物のグループです6。 N-ニトロソ アルキル化合物、特にジエチルニトロソアミン (DEN) は、肝臓、肺、血液などのさまざまな臓器にさまざまな種類や段階の悪性腫瘍を引き起こす可能性があり、実験動物 (最も一般的にはラット) のがんを促進する誘発化学物質として広く使用されています。 7。 ジエチルニトロソアミンは、乳製品、燻製および塩漬けの魚や肉、大豆、アルコール飲料など、多くの食品の防腐剤として以前から十分に確立されていました。 食品産業では、微生物の増殖阻害剤、保存料、着色料、風味安定剤としていくつかの化学物質が添加されます。 最も有名なのは亜硝酸塩が使用されることです。 亜硝酸塩は高温と胃酸性液の影響でニトロソアミンに変化し、その結果、これらの種類の食品がこれらの有毒物質の主な供給源となり、そのためこれらの化学物質は食品加工において防腐剤として使用されなくなりました8。 ヒダントイン (グリコリル尿素としても知られ、グリコール酸と尿素の反応から生じる) とその誘導体 (およびその他の分子) は、複素環式化合物 (有機) のグループであり、非常に重要かつ不可欠な化学物質であると考えられています。多くの生物学的および薬理学的アプローチ、医薬品化学および農薬応用において極めて重要な役割を果たしていることに加えて、それらは多くの重要な非天然アルファアミノ酸およびその結合体の化学的および酵素的合成のための重要な前駆体を表します。医学的に重要な。 ヒダントインは無色の固体であり、イミダゾリジンの酸化の誘導体であり、式 C3H4N2O29 を持ちます。 チオヒダントインとその誘導体は、高い生理活性と治療の可能性があるため、今日科学者や研究者にとって注目を集めています。 チオヒダントインは、化合物ヒダントイン (イミダゾリジン-2,4-ジオンとしても知られる) の硫黄 (S またはチオ) 類似体で、1 つまたは 2 つのカルボニル基がチオカルボニル基で置き換えられています10。 この分子グループに関する興味深い事実の 1 つは、それらの生物学的活性が置換基の性質に応じて変化し、影響を受けるということです。 かなりの数のチオヒダントイン誘導体は、さまざまなアルデヒドの縮合反応によって古典的に調製できます11、12。 このクラスの複素環式化合物の主な生物学的応用の中で、治療活性および薬理学的目的には、抗腫瘍活性、抗細菌活性、抗寄生虫活性、抗マラリア活性、抗真菌活性、抗てんかん活性、抗てんかん活性、メラニン生成活性10． EGFRおよびVEGFR増殖因子受容体の強力な阻害剤の開発において、有効な薬理成分としてチオヒダントイン環が出現したことに注目することは興味深い。 さらに、チオヒダントイン誘導体は、アンドロゲン受容体および TNF アンタゴニストであるだけでなく、DNA トポイソメラーゼ I、II (TopI、II)、NOX、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ (IDH)、B 細胞リンパ腫 2 (Bcl- 2) およびサーチュイン (SIRT)、キネシン紡錘体タンパク質 (KSP)、プロリルヒドロキシラーゼ 1 ～ 3 (PHD 1 ～ 3)、CDK2、および CDK4.11、25。 本研究の目的は、DEN 誘発性肝損傷のラットモデルにおいて、新しいチオヒダントイン誘導体 5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン (5B2T) の肝保護効果をテストすることでした。

本研究では、新たに合成されたチオヒダントイン誘導体 5B2T を実験室で実験的に調製し、肝障害の治療薬として使用しました。

化合物のすべての融点は、Griffin 装置で測定されました。 赤外スペクトルは、SHIMADZU CORP シリーズの FTIR 装置を介して 4000 ～ 600/cm の範囲で記録されました。 ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を使用してＢｒｕｋｅｒ ＤＰＸ ４００（４００ＭＨｚ）分光計で測定した。 化学シフトは、TMS (0.00) ppm に関連する ppm (δ) で測定されました。 高分解能質量分析データは、特に報告がない限り、Gilson 232XL オートサンプラーを使用した Waters Q-TOF マイクロ質量分析計でエレクトロスプレー (ES) モードで取得しました。

市販の２－チオヒダントインを、必要なアルデヒドとともに、マグネチックスターラーおよび還流冷却器を備えた丸底フラスコに、窒素雰囲気下、トリエチルアミンおよび水中に入れた。 混合物を室温で一晩撹拌し、3M HClを加えることによりpHを3に調整した。 固体生成物を濾別し、ジエチルエーテルおよび水で洗浄した。 純粋な化合物を収集し、乾燥させた13。

5B2T（最終生成物）は、ベンズアルデヒドおよびトリエチルアミンの存在下、エタノールに溶解した市販のヒダントインを使用し、一晩H2O還流下で合成しました（これは試験反応の成功後に行われました）。

OECD-423 ガイドラインに従い、実験マウスに 2 g/kg および 5 g/kg の単回投与により、新規合成化合物 5B2T の安全性を確認しました 14。 簡単に説明すると、36 匹の健康なマウス (雄 18 匹と雌 18 匹) を、それぞれビヒクル (dH2O)、低用量 (2 g/kg) および高用量 (5 g/kg) の 5B2T としてラベル付けされた 3 つのグループに分けました。 各マウスは、投与前に一晩絶食させられた。 投与後さらに 3 ～ 4 時間は食事を控えました。 動物は、急性臨床毒性、罹患率および死亡率の兆候を検出するために、投与後 30 分間、および 2、4、24、および 48 時間後に注意深く観察されました。 行動観察には、呼吸（呼吸困難）、唾液分泌、皮膚の立毛、視床外、けいれん、運動の変化が含まれます。 14 日間生存させた後、15 日目にマウスを屠殺し、標準的な方法に従って血清生化学 (肝臓および腎臓) パラメーターを測定しました 15。

この研究では、体重 200 ～ 250 g、平均年齢 3 ～ 4 か月の健康な成人雄ラット 42 匹を使用しました。 これらは、動物舎ユニット/薬学部/ホーラー医科大学から入手しました。 動物には標準的な餌と水道水を与えました。 動物は、薬学部/ホーラー医科大学の倫理委員会の許可の下、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイド16の倫理原則に従って扱われ、人間のケアを受けました（番号2021.25.08-） 205 HMU.PH.EC)。 すべての方法は ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されます。 実験前の少なくとも 1 週間、動物を 22 ± 3 °C、湿度 50 ～ 60%、12 ～ 12 時間の明暗サイクル下で維持しました。 ラットを 3 つのグループに分類しました (n = 12)。 用量の投与は、ラットの体重(BW)を考慮して行われた。 グループ I には実験全体を通じて 10% Tween 80 が与えられ、プラセボ グループとみなされます。 グループ II のラットには、Rezaie らの方法 6 に従って DEN の 200 mg/kg6 単回用量の腹腔内注射が行われ、肝損傷陽性対照群として機能しました。一方、グループ III のラットには 50 mg/kg の 5B2T が経口投与されました。治療は 2 つの期間に分けて行われ、最初の期間は 3 週間続き、2 番目の期間は 6 週間続きました。 実験の最後に、すべてのラットを屠殺し、生化学分析およびELISAによる炎症誘発性サイトカイン分析のために血液を採取した。 採取したラットの肝臓の組織を10%ホルマリンで固定し、一連の水和反応と脱水反応を行った。 次に、それらを包埋、切片化、処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色し、核タンパク質 (Ki-67) および肝細胞特異的抗原 (HSA) である特異的抗体の検出をテストしました。

リガンド分子の 2 次元 (2-D) 構造 (図 1) は、chemdraw professional 16.0 を使用して構築され、Chem3D 16.0 モジュールを使用して 3 次元 (3-D) 構造に変換され、pdb 形式の構造 (http ://www.cambridgesoft.com/)。 リガンドはガイスター電荷と水素を追加することで最適化され、リガンドの pdbqt 形式は AutoDock Tools 1.5.7 で作成されました。

5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン。

次に、リガンド分子を AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) への入力として使用して、ドッキング シミュレーションを実行しました。

壊死因子 TNF-α (PDB ID:1TNF) およびヒト インターロイキン-6 IL-6 (PDB ID: 1IL6) のターゲットの X 線結晶構造は、RCSB Protein Data Bank Web サーバー (http:// www.rcsb.org/pdb/)。 Discovery Studio Visualizer 2021 を使用して活性結合部位を特定しました。グリッドの寸法は、座標 x、y に従って 8.41 × 64.05 × 31.20 (PDB ID:1TNF)、および 3.49 × − 3.45 × 0.44 (PDB ID: 1IL6) に設定されました。 、z、Discovery Studio Visualizer 2021 で特定されたターゲットの活性結合部位。水分子が受容体から除去され、極性水素とコールマン電荷が追加されました。 レセプターの pdbqt 形式は AutoDock Tools 1.5.7 によって生成されました。 AutoDock Vina は、Windows 10.0 Professional オペレーティング システムでコンパイルされ、実行されます。 Discovery Studio 2021 は、リガンドと標的タンパク質の間の相互作用を図で表現するために使用されました。

選択した標的に対するリガンドの結合親和性 (ki) を計算し、式 1 を使用して評価しました。 (1)

ここで、\(\Delta G\) は kcal/mol 単位の結合エネルギー、室温 (25 °C) T = 273 + 25 = 298 K での普遍気体定数 R = 1.987 kcal/K/mol です。Ki は阻害定数。ここで、Ki は主に mM17 の単位を持つ結合 (または結合) 定数 (Kb) に依存します。

薬物動態および物理化学的パラメーターの予測は、医薬品設計において重要な役割を果たします18。 薬物様特性の評価は、SwissADME (http://www.swissadme.ch/) および admetSAR (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2) を使用して 5BT について評価されました。19 薬物様分子はリピンスキーの 5 の法則 (RO5) に従います。活性経口薬の分子量 MW は 500 Da 以下でなければなりません。 log p は < 5 である必要があります。 水素結合アクセプターの数は nOH ≤ 10 である必要があります。 水素結合供与体 nOHNH の数は 5 以下である必要があります。 回転可能な結合の数は 1020 以下である必要があります。

材料と方法のセクションで述べた調製方法を利用して、チオヒダントイン (2.0 g、17.2 ミリモル)、トリメチルアミン (4.9 ml、37 ミリモル) およびベンズアルデヒド (1.9 ml、19 ミリモル) を 50 ml の水に加えました。 収率 = 69.9%、融点 270 ～ 272 °C、C10H8N2OS について計算された HRMS m/z [M + H] + 204.0358; 204.0358 が見つかりました。 1H-NMR (400 MHz、DMSO-d6): δ 12.41 (s、H、NH)、δ 12.19 (s、H、NH)、δ 7.74 (d、J = 7.4 Hz、2H、phen)、δ 7.45 –7.37 (m、3H、フェニル)、δ 6.49 (s、H、CH=C)。 13C-NMR (101 MHz、d6-DMSO): δ 177.3 (C=S)、δ 164.0 (CO)、δ 130.5 (C=CH)、δ 128.6 (2xCH)、δ 127.3 (C)、δ 127.0 (2xCH) ）、δ 126.0 (CH)、δ 109.7 (CH=C)。 ＩＲ（ニート）：ｖｍａｘ＝３２２５／ｃｍ（ＮＨ）、１７２３ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ）、１４７５／ｃｍ（Ｃ＝Ｓ）、１６４３／ｃｍ（Ｃ＝Ｃ）。

高用量（2 g/kg および 5 g/kg）の 5B2T で治療した実験マウスは、活動的な健康状態で 14 日間生存し、明らかな毒性の兆候はなく、死亡例も記録されませんでした。 血液生化学検査から得られた結果は、表 1 および 2 に示すように、治療群と対照群の間に差が見られなかったことを示しており、5B2T は経口投与しても安全であり、致死量 (LD50) は男女とも 5 g を超えていたことが示唆されています。 /kg。

本研究の結果（図2）は、DENの投与が最初のグループ（DEN処置ラット）の生化学的パラメーターの有意な上昇を引き起こしたのに対し、5B2Tによる処置は同じ生化学マーカーの顕著な減少を引き起こしたことを示した。 同時に、ELISA の結果は、DEN で治療したラットにおける炎症促進性サイトカイン (TNF-α および IL-6) の有意な増加、特に 5B2T 治療したラットにおける同じサイトカインのレベルの低下を反映しました (図 3)。

肝臓生化学パラメータに対する 5B2T の影響。 X 軸は治療グループを示し、Y 軸は肝機能パラメータを示します。DEN: ジエチルニトロソアミン、T: 10% tween 80、5B2T: 治療グループ。 AST：酢酸アミノトランスフェラーゼ、ALT：アラニンアミノトランスフェラーゼ、ALP：アルカリホスファターゼ。

炎症誘発性サイトカインである TNF-α および IL-6 レベルに対する 5B2T の効果。 X 軸は治療グループを示し、Y 軸はサイトカイン レベルを示します。DEN: ジエチルニトロソアミン、T: 10% tween 80、5B2T: 治療グループ。 TNFα：腫瘍壊死因子α、IL-6：インターロイキン6。

プラセボ (10% Tween 80) 処置ラットの肝臓切片の組織病理学的検査では、両方の期間 (3 週間および 6 週間) で完全に正常な組織学的特徴が示されました (図 4A および B)。 DEN を 3 週間投与すると、肝構造の大幅な変形、類洞の拡張、門脈領域周囲の大量の線維化に代表される、非常に顕著な肝損傷が示されました (図 4C)。 DEN を 6 週間順番に投与すると、肝切片に大規模な異常な組織学的特徴が生じ、これに伴う中心静脈領域周囲の炎症細胞の浸潤が発生しました。これは、炎症および肝臓損傷の進行段階の指標となります。 さらに、肝性皮疹および腺腫とともに、毛細胆管の拡張が認められました（図 4D）。 DEN および 5B2T で治療したラットは、両方の期間 (3 週間および 6 週間) で、試験した肝臓切片の組織病理学的外観に劇的な改善を示しました (図 4E および F)。

肝臓セクション、H&E。 400×。 (A) プラセボ グループ/3 週間、肝索 (黒い矢印) および中心静脈 (青い矢印) の正常な組織学的特徴を示します。 (B) プラセボ群 / 6 週間、門脈領域の血管 (黒い矢印)、胆汁 (青い矢印)、肝細胞 (赤い矢印) の正常な組織学的特徴を示します。 (C) DEN グループ/3 週間。門脈周囲の線維化 (黒い矢印)、クッパー細胞の過形成 (青い矢印)、および類洞の拡張 (赤い矢印) を示します。 (D) DEN グループ/6 週間。肝細胞腺腫 (黒の矢印)、クッパー細胞の過形成 (青の矢印)、空胞変性 (赤の矢印)、凝固性壊死 (紫の矢印)、類洞の拡張 (緑の矢印) を示します。 (E) 5B2T グループ/3 週間は、尖胆汁の過形成 (黒の矢印)、壊死性肝細胞 (青の矢印)、および炎症細胞の浸潤 (赤の矢印) を示します。 (F) 5B2T グループ/6 週間、ShowS 軽度の皮疹 (青色の矢印)、および少数の肝細胞が細胞変性を示しました (赤色の矢印)。

免疫組織化学的変化は、2 つの肝臓マーカー、Ki-67 および HSA の発現をスクリーニングすることによって評価されました。 プラセボ群（グループ I）の所見では、3 週間目と 6 週間目の肝細胞の核に Ki-67 抗体による陰性染色が示されました（図 5A および B）。 対照的に、DEN 処置ラット (グループ II) は、1 回目と 2 回目の期間、影響を受けた肝細胞において Ki-67 抗体による陽性染色を示し、影響を受けた細胞核は暗褐色に染色されました (図 5C および D)。 5B2T 処置ラット (グループ III) の染色肝臓組織切片は、最初の期間 (3 週間) は、影響を受けた肝細胞の細胞質内で金茶色の顆粒として Ki-67 抗体による弱い陽性染色を示しました。 一方、2回目の期間（6週間）のラット組織切片では、損傷肝細胞の細胞質にKi-67抗体による弱い陽性染色と、金茶色の顆粒の外観が示されました（図5EおよびF）。 さらに、10% Tween 80 処理ラット (グループ I) の切片は、1 回目と 2 回目の期間、肝細胞の細胞質において HSA 抗体による陰性染色を示しました (図 6A および B)。 DEN 処置ラット (グループ II) の組織切片は、影響を受けた肝細胞で HSA 抗体による強い陽性染色を示し、最初と 2 回目の期間は金茶色の細胞質顆粒として染色され、影響を受けた細胞核は暗褐色に染色されました (図.6CおよびD）。 5B2T 処置ラット (グループ III) の染色された肝組織切片は、実験の最初の期間 (3 週間) は、影響を受けた肝細胞の細胞質に金茶色の顆粒として HSA 抗体による弱い陽性染色を示しました。 一方、2回目の期間（6週間）では、組織切片は、金茶色の顆粒の外観を備えた損傷肝細胞の細胞質におけるHSA抗体による弱い陽性染色を明らかにしました（図6EおよびF）。

肝臓セクション、IHC Ki67 -ab。 400×。 (A) プラセボ グループ/3 週間は、肝細胞の核における Ki67 抗体による陰性染色を示します (赤い矢印)。 (B) プラセボ グループ/6 週間は、肝細胞の核における Ki67 抗体による陰性染色を示します (赤い矢印)。 (C) DEN グループ / 3 週間、核を暗褐色に染色した影響を受けた肝細胞で Ki67 抗体による陽性染色を示し (赤色の矢印)、他の細胞要素の非特異的染色に注目してください (黒色の矢印)。 (D) DEN グループ/6 週間は、影響を受けた肝細胞において Ki67 抗体による陽性染色を示し、核が暗褐色に染色されました (赤い矢印)。 (E) 5B2T グループ/3 週間では、Ki67 抗体による肝細胞の核の陽性染色がほとんど見られません (赤い矢印)。 (F) 5B2T グループ/6 週間、Ki67 抗体による肝細胞の核染色陰性を示します (赤い矢印)。

肝臓セクション、IHC HSA -ab。 400×。 (A) プラセボ グループ/3 週間は、肝細胞の細胞質における HSA 抗体による陰性染色を示します (赤い矢印)。 (B) プラセボ グループ/6 週間、肝細胞の細胞質における HSA 抗体による陰性染色を示します (赤い矢印)。 (C) DEN/3 週間。影響を受けた肝細胞では HSA 抗体による強い陽性染色が示され、細胞質の金褐色顆粒として染色され (赤い矢印)、他の肝細胞では非特異的な染色が認められます (黒い矢印)。 (D) DEN グループ/6 週間は、影響を受けた肝細胞において HSA 抗体による強い陽性染色を示し、細胞質の金褐色顆粒 (赤い矢印) として染色されました。 (E) 5B2T グループ/3 週間では、肝細胞の細胞質に HSA 抗体によるわずかな弱い陽性染色が金茶色の顆粒として示されています (赤い矢印)。 (F) 5B2T グループ/6 週間は、肝細胞の細胞質に HSA 抗体によるわずかな弱い陽性染色が金茶色の顆粒として示されています (赤い矢印)。

薬物と受容体間の正しい吸収と結合は、分子ドッキングと呼ばれます。 リガンドと受容体の最も重要な相互作用はドッキング エネルギーが最も低くなります。 AutoDock Vina を使用して、親和性、結合の立体構造、および最適なリガンドを評価しました。 どちらのリガンドについても、複数のドッキングポーズのうち、最も高いドッキングスコアのみが研究に含まれました。 TNF-αおよびIL-6で観察された結合力、水素結合相互作用の数、および相互作用へのアミノ酸の関与に関するすべてのデータを表3および図1〜3に列挙する。 7と8。

5B2T と TNF-α の相互作用の 2D および 3D 表示 (PDB ID: 1TNF)。

5B2T と IL-6 の相互作用の 2D および 3D 表示 (PDB ID: 1IL6)。

5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン (5B2T) は TNF-α (PDB ID:1TNF) と結合して形成します。 それぞれ、PRO A: 117、TYR C:119: 116、LYS C:98、TYR A: 119、ILE C:118、および IL-6 (PDB ID: 1IL6) と ARG A:169 で水素結合します。 一方、PRO A:117、ILE A:118、5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン (5B2T) 結合と TNF-α (PDB ID:1TNF) および IL-6 (PDB ID: 1IL6) との間の疎水性相互作用が観察されました。それぞれ、ALA A:96、PRO B:117、LEU A:166、LEU A:65、PRO A:66。 GLU A: 173 と形成されたパイアニオン相互作用と、5B2T と PHE A の間に好ましくないドナー-ドナー結合が観察されました。 IL-6 (PDB ID: 1IL6) の 174 アミノ酸 (図 7 および 8)。

インシリコ ADME/T と 5B2T の薬剤類似性予測は、admetSAR と SwissADME を介して理論的に計算されました。 分子量 204.25 (g/mol) は、許容可能な ADMET 範囲の特性を備えています。 78% という有意な値は、血液脳関門を通過する可能性が高いことを示しました。 ヒトの腸管薬物吸収率 98.73% は許容範囲内 (> 80) でした。 オクタノールと水の分配係数 (Log P) 1.03 は 5 未満であることが判明し、違反は 1 つだけ許可されます。 トポロジカル表面積 (TPSA) は許容範囲内 (< 140) であることがわかりました。 さらに、水素結合アクセプター (HBA) とドナー (HBD) は、それぞれ 3 ～ 6 と 2 ～ 4 の範囲にあることがわかりました (表 4)。

本研究では、クネーフェナーゲル縮合条件下で (Z)-5-ベンジリデン-2-チオキソイミダゾリジン-4-オンを合成しました。 5B2T の 1H-NMR スペクトルは、δ 6.49 ppm で二重結合 (CH=C) 上の水素の典型的な一重項シグナルを示し、δ 7.45 ～ 7.37 ppm で 3 つの芳香族プロトンが多重シグナルとして表示され、2 つの芳香族プロトンが表示されました。 δ7.74 ppmのダブレットとして（d、J = 7.4 Hz、2H、phen）。 1H-NMR スペクトルでは、二重結合上の水素の典型的なシグナルと 5B2T の芳香環シグナルの間に重複は見られませんでした。 13C-NMR スペクトルは、5B2T に存在する炭素数と一致するシグナルを示しました。 一方、 13 C-NMR スペクトルは、5B2T の各炭素原子の 1 つの炭素シグナルによって表される 1 つの立体異性体の存在を示しました。 クネーフェナーゲル縮合では、E および Z の幾何異性体がクネーフェナーゲル縮合中に発生する可能性がありました。 一方、13C-NMR スペクトルは 5B2T の 1 つの異性体と Z 異性体の立体配置を示唆しており、この立体配置はカルボニル基と CH = フェニル環の間の立体障害が少ないため熱力学的安定性が高いことを示唆しています 21。

DEN はよく知られた発がん性化学物質であり、多くの実験動物にとって急性肝毒素です。 DEN の長期投与は肝腫瘍を引き起こすことが証明されています。 実験用げっ歯類に 200 mg/kg DEN を 1 回腹腔内注射すると、不可逆的な肝損傷を効果的に誘発できます 22。 DEN が肝障害や肝がんを誘発する主な要因は、この物質が活性酸素種 (ROS) を生成し、酸化ストレスや DNA、脂質、タンパク質の損傷を引き起こす可能性が高いことです。 DEN がこれらの作用を確立できるようにするには、まずシトクロム p450 と呼ばれる体内の酵素によって代謝される必要があります。これにより、DEN は高レベルの ROS を生成し、細胞膜の脂質過酸化とアルキル化を介した DNA 付加物が生じ、その結果、細胞の損傷や損傷。 実験動物への DEN の投与が成功すると、肝細胞癌 (HCC) が 100% 誘発されます 23。 この研究では、肝障害の治療における 5B2T (薬物様分子) の肝保護効果を評価するために、実験動物/雄ラットに肝損傷と癌を誘発するために 200 mg/kg DEN の単回腹腔内注射が使用されました。 生化学分析の結果を図 2 に示します。DEN の投与により、肝疾患の指標としてアミノトランスフェラーゼ (ALT、AST、ALP) を含む肝生化学マーカーのレベルが顕著に血清上昇したことが明らかです。肝臓の損傷と代謝活動の不安定性。 この上昇は、DEN24 によって誘発された細胞損傷による原形質膜の破裂後の血液循環へのこれらの酵素の細胞質放出に起因すると考えられます。 アルカリアミノトランスフェラーゼ (ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、およびアルカリホスファターゼ (ALP) は、肝障害の診断において最も感度の高い血清生化学バイオマーカーであることが知られています 25。 5B2T の経口補給は、以前に DEN によって誘導された血清酵素レベルの強力な低下を示しました。 多くの研究がこれらの結果を支持し、DEN26 によって誘発される HCC に対するニンニク油を評価する研究を含む、DEN 誘発発がん時の肝臓の生化学マーカーのレベルが同様に高かったことを報告しました。 これは、5B2T が DEN によって誘発されたラットの腫瘍進行を阻害する能力を示唆しており、これは使用された治療の能力が細胞の原形質膜の単一性と完全性を維持し、細胞膜の内部からのこれらの細胞質酵素の漏出を防ぐ能力に起因している可能性があります。細胞は膜を通って外部に放出され、肝保護活性を発現します。 これは、5B2T の投与後に生化学マーカーが活性を回復した理由でもある可能性があり、金属の種類、リガンドの種類、ドナー原子などの他の要因も寄与している可能性があります。 この研究には、生化学的評価に加えて、肝臓に対する誘導剤と治療の両方の効果をさらに詳しく説明するための酵素結合免疫吸着エッセイ（ELISA）技術の評価も含まれていました。 図 3 は、炎症誘発性 TNFα および IL-6 サイトカイン レベルに対する 5B2T の効果を示しています。 DEN で治療したラットでは、炎症誘発性サイトカインの血清レベルの強い上昇が観察され、これらの結果は癌と炎症 (特に TNF-α と IL-6) に関連しており、DEN27 の投与後に上昇することが証明されています。 。 対照的に、5B2T で治療されたラットでは、これらのサイトカインのレベルが顕著に減少したことが明らかになりました。 TNF-αは、分子量55 kDaのp55およびp75受容体の発現によって細胞傷害効果を媒介するため、細胞膜のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および内皮ミトコンドリアにおける(ROS)活性酸素種の誘導も、TNF-αは電子伝達鎖を破壊します。ミトコンドリア複合体では、核因子-カッパベータ活性化の刺激およびIL-6発現の上方制御に加えて、28。

これらの所見は、試験した肝臓切片における組織病理学的および免疫組織化学的改善によって裏付けられました。 DEN の投与後、肝臓の特徴的な組織学的特徴は歪められ、組織化されず、失われていました。 これは、酸化ストレス、細胞膜の完全性の喪失、炎症細胞の浸潤、最終的には正常な肝細胞から腫瘍細胞への形質転換など、一連の反応によって起こる可能性があります29。 図 4 は、病理組織学的結果を示しています。 実験の最初の期間にDEN治療したラットから採取した組織病理学的に検査した肝臓切片の顕微鏡結果から、主に門脈領域の線維化と類洞の拡張に代表される、肝臓の大きな変形と損傷が明らかになった。 一方、6週間のDEN投与期間では、中心静脈領域の炎症細胞の浸潤、毛細胆管の拡張、皮疹および腺腫によって示される、より重篤かつ進行した段階の肝損傷が示され、長期的な破壊的影響を裏付けています。肝臓にDENの。 ラットにおける DEN 誘発肝毒性に対するショウガの効果を評価した研究でも同じ結果が見られ 30、肝臓に対する DEN の有害な影響が裏付けられています。 対照的に、3週間治療した5B2Tラットの肝臓切片では、肝臓の全体的な構造が改善され、線維化細胞や炎症細胞が減少したことが示されました。 同時に、5B2Tで6週間治療したラットは、DENの破壊的効果の阻害を示しただけでなく、最初の治療期間よりも大幅に組織学的特徴の部分的から完全な回復も示した。 さらに、2 つの主要な肝臓特異的抗体、Ki-67 および HSA の免疫組織化学的評価を図 1 および 2 に示します。 プラセボ群は、試験した組織細胞の核においてKi-67およびHSAの陰性染色を示した。 DEN 処置ラットの組織切片では、両方の実験期間にわたって Ki-67 および HSA 抗体に対する強い陽性染色が明らかになりました。これは、肝細胞に対する DEN の悪影響を積極的に裏付けています。 ラットの DEN 誘発 HCC における Ki-67 を評価するために行われた研究では、DEN 誘発後に Ki-67 陽性細胞数の有意な増加が観察されました 31。 5B2T による治療は予後を改善する興味深い結果を示し、これは進行段階の肝損傷の治癒における化学物質の高い有効性を反映しています。 3 週間および 6 週間治療したラットの HSA について試験した肝臓切片では、影響を受けた肝細胞の細胞質に弱い陽性染色が示されました。 これらの結果を Ki-67 の評価と比較すると、投与量に関係なく (すなわち、薬物投与量の安定性と)、治療期間が長いほど薬物の有効性の増加と直接比例関係があることを示唆する、より興味深い結果が見つかりました。 。 5B2T で 3 週間治療したラットの試験切片では、Ki-67 Ab で陽性染色された核はほとんど示されませんでした。 対照的に、6 週間の治療期間の結果では、Ki-67 Ab による完全な陰性染色が示されました。 薬物様分子のチオヒダントイン グループのこのユニークな誘導体の注目すべき治癒能力は、その 5 位に立体中心を持っていることに起因している可能性があります 32。 それにもかかわらず、チオヒダントインのこれらの化学誘導体は、肝臓の炎症および損傷受容体をブロックし、それらの発現を阻害することができるとも考えられています。 例えば、2-チオヒダントイン誘導体は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NAPDH）オキシダーゼ（NOX）などの重要な酵素の阻害活性において主要な役割を果たしていると考えられており、NOXはクレブス回路や宿主の範囲測定において重要な役割を果たしています。炎症および細胞シグナル伝達に対する防御、およびトリカルボン酸サイクルで重要な役割を果たすイソクエン酸デヒドロゲナーゼ (IDH) 10。 チオヒダントイン グループは、ヒト細胞に対する毒性が低いため、抗菌剤および抗がん剤としての薬理学的用途、特に 2-チオヒダントイン誘導体として広く知られています。 前述したように、5B2T 誘導体は、調製が容易であり、さらに重要なことに、5 位に立体中心を持っているため、将来肝障害の治療法として使用できる貴重かつ有望な選択肢です 33。 最も高い結合部位 (- 7.1 kcal/mol) は、5B2T と TNF-α の相互作用に対する強い結合部位親和性を示唆しています。 5B2T は、GLU B161、GLU C:116、PRO100 と 3 つの水素結合を確立し、GLU173 と 1 つの疎水結合を確立します。 IL-6 (PDB ID: 1IL6) 結合部位と 5B2T の相互作用は、-6.1 (Kcal/mol) という有意な結合部位エネルギーを持ち、SER170 と 1 つの水素結合を確立し、LEU 65、166、および PRO 66 と 3 つの疎水結合を確立します。 Lipinski と彼のチームによると、5B2T の ADMET 分析は、薬物様分子の 5 の法則 (RO5) と一致することが判明しました 34。 分子量は < 500/gmol であり、参照範囲に従っています。 血液脳関門 (BBB) + 値は、許容範囲内にある化合物の BBB 通過能力を表します。 トポロジカル表面積 (TPSA)、log p、水素結合アクセプター (HBA) およびドナー (HBD) が許容範囲内であることが判明しました。 この値は、5B2T が人間の腸で吸収され、非毒性、非発がん性の化合物であることを示しています。 すべての値は、5B2T がリピンスキーの 5 の法則 (Ro5) および Veber の規則を満たしていることを明らかにしました。5B2T の有望な結果は、それらが薬剤候補として使用できることを示しています。 この研究では、5-ベンジリジン-2-チオヒダントイン化学物質（麻薬様物質）の肝保護効果を評価するために、実験動物/雄のウィスターラットに肝臓損傷と癌を誘発するために、200 mg/kg の DEN を単回腹腔内注射しました。肝障害の治療における分子）の実験をまとめたものを図 9 に示します。 Tween 80% のうち 10% の投与を研究の対照とみなしました。 DENで治療されたラットは大規模な肝損傷を引き起こし、特に肝臓の生化学マーカー（総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）の上昇と、炎症促進性サイトカインの上昇（腫瘍壊死因子アルファ）を​​引き起こした。インターロイキン-6) と高レベルの HAS および ki-67 抗体が検出され、最終的には肝臓構造の喪失をもたらしました。 5-ベンジリジン-2-チオヒダントインで治療したラットは、同じ肝臓マーカーの減少で表される肝臓の機能と構造を顕著に回復させた。 これらの結果は、金治療の特徴と肝臓保護活性が期待できることを強く裏付けています。

ジエチルニトロソアミンによって誘発される肝損傷に対する 5-ベンジリジン-2-チオヒダントインの効果。 DEN: ジエチルニトロソアミン、TNFα: 腫瘍壊死因子α、IL-6: インターロイキン 6。TB: 総ビリルビン、DB: 直接ビリルビン、AST: 酢酸アミノトランスフェラーゼ、ALT: アラニン アミノトランスフェラーゼ、ALP: アルカリホスファターゼ。

実験的には、合成された化学物質 (5-ベンジルリジン-2-チオヒダントイン) は、肝臓生化学マーカー、炎症誘発性サイトカイン (TNF-α および IL-6)、免疫組織化学所見によって表される誘発性肝損傷に対する治療特性を明確に確立しました。 また、分子ドッキングの結果では、5-ベンジリジン-2-チオヒダントインと炎症誘発性サイトカインの間の異なる部位で高エネルギーで強力に結合していることが示され、肝臓治療としての化学物質の有効性が示されました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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ホーラー医科大学薬学部薬学学部、エルビール、44001、イラク

ラナ・S・アクリー & ザーラ・A・アミン

ホーラー医科大学薬学部薬化学部、エルビール、44001、イラク

ヒワ・O・アハマド

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HO が化学物質を準備し、LA が動物実験を行い、LA と ZA がデータを分析し、LA が原稿を書き、ZA と HO が原稿を修正します。

ザーラ・A・アミンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Akree, LS, Amin, ZA & Ahmad, HO ラットモデルにおけるジエチルニトロソアミン誘発肝損傷に対する合成 5-ベンジリデン-2-チオヒダントインのインシリコおよびインビボ肝保護活性。 Sci Rep 13、4681 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27725-x

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受信日: 2022 年 6 月 16 日

受理日: 2023 年 1 月 6 日

公開日: 2023 年 3 月 22 日

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